Transfert trophique de la cyanotoxine microcystine-LR : bioaccessibilité et biodisponibilité chez le consommateur

Les microcystines (MC) sont des hépatotoxines produites par diverses cyanobactéries. La prolifération massive de cyanobactéries productrices de MCs peut présenter des effets délétères pour la faune mais aussi pour l'homme en raison de l'exposition, notamment par contact ou par ingestion (eau et organismes aquatiques contaminés). Les MCs peuvent s'accumuler dans les matrices biologiques sous plusieurs formes : libres dans la cellule ou liées de manière covalente à diverses protéines (PPAses, cystéine, glutathion, ...) dans les organismes. Les formes totales de MCs (libres + liées de manière covalente) sont encore rarement surveillées et pourtant elles constituent une forme majeure d'accumulation dans les réseaux alimentaires aquatiques. Ce projet de doctorat vise à i) améliorer les méthodes d'extraction et d'analyse par LC-MS/MS des formes totales de MC dans les tissus d'organismes d'eau douce, ii) évaluer la cinétique d'accumulation des MC libres et liés aux protéines dans la chair et les organes des poissons d'eau douce, iii) développement d'une méthode de digestion statique pour déterminer la bioaccessibilité des MC totales.Trois méthodes d'extraction des formes libres dans la chair de diverses espèces de poissons (saumon, truite et carpe) ont d'abord été comparées en utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). La méthode donnant les meilleures récupérations et des effets de matrice comparables pour les deux poissons et les variants de MC testées (MC-LR, MC-RR), ainsi qu'un processus d'exécution rapide et facile, a ensuite été optimisée et validée selon l'approche des critères inspirée de la norme V03-110. Pour les MCs totales, deux protocoles d'oxydation de Lemieux ont été comparés sur différentes matrices fraîches et lyophilisées (poisson et moule d'eau douce). Le protocole le plus récent a donné de meilleurs rendements moyens (66%) que celui couramment utilisé dans la littérature (33%). Différentes méthodes de quantification (courbe d'étalonnage dans le solvant, courbe d'étalonnage adaptée à la matrice et courbe d'étalonnage utilisant le MC-LR oxydé en MMPB, avec ou sans étalon interne) ont également été comparées pour chaque protocole. L'utilisation de l'étalon interne d3-MMPB a donné de meilleurs rendements pour les deux méthodes de Lemieux.La déconjugaison à pH basique a été choisie, non seulement pour sa nouveauté concernant l'analyse des cyanotoxines mais aussi parce que cette technique permet, contrairement à l'oxydation de Lemieux, de conserver l'information sur l'identité des variants de MCs. La déconjugaison a été appliquée aux conjugués MC-protéines (MC-Cys, MC-Gsh) et aux matrices aquatiques avec NaOH [0,5 µM]. Pour éviter la reconjugaison des MC avec les protéines, du borohydrure de sodium [0,4M] a été utilisé pour réduire et obtenir des MC déconjuguées non réactives. Une déconjugaison complète des MC-Gsh a été obtenue après 1 heure de réaction et après 4 heures pour les MC-Cys avec une réduction des MC déconjuguées entre 6 et 22 heures pour les deux types de conjugués.En raison du manque de connaissances sur la cinétique d'accumulation et de dépuration des MCs totaux chez les poissons, une expérience a été menée sur des carpes juvéniles, nourries avec des aliments pour poissons enrichis en MC-LR, pendant 7 jours suivis d'une période de dépuration de 21 jours. Des analyses des MCs totaux par oxydation Lemieux ont été réalisées dans la chair et le foie des carpes exposées à MC-LR mais n'ont pas révélé d'accumulation de MCs.Enfin, un travail préliminaire sur la bioaccessibilité des formes totales de MCs a été réalisé. Le protocole harmonisé de digestion statique INFOGEST a été mis en œuvre en laboratoire et testé sur des moules d'eau douce naturellement contaminées par des MCs.

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