Le projet GinFiz vise à développer et tester de nouvelles méthodes pour caractériser les effets non-intentionnels des produits phytopharmaceutiques sur les populations de poissons, en particulier les impacts résultant d’atteintes du système endocrinien des individus. L’objectif global du présent projet sera donc le développement et l’amélioration d’une qAOP conduisant à une baisse de la fécondité afin de prédire précisément les impacts des PE pour les différents niveaux biologiques (des doses internes accumulées jusqu’aux effets sur les populations). Pour cela, trois objectifs seront visés : (i) Enrichir la version quantitative de l’AOP basée sur l’aromatase A, en particulier, pour prédire précisément les impacts sur les populations, en utilisant les modèles mathématiques mécanistes disponibles à l’Ineris pour le poisson zèbre [18, 20], les données toxicologiques produites dans le projet AIDEZ, et en produisant de nouvelles données sur la dynamique des hormones stéroïdiennes. (ii) Intégrer à cette qAOP une autre voie de toxicité pour les PE impactant probablement la voie de signalisation des progestatifs et conduisant à une diminution de la fécondité du poisson zèbre. (iii) Utiliser cette qAOP, ainsi que l’ensemble des données produites, dans un contexte réglementaire afin d’en démontrer l’intérêt dans la mise en œuvre du guide ECHA/EFSA pour l’identification des propriétés PE.

Certains composés chimiques possèdent la capacité de perturber le système endocrinien ; ils peuvent conduire, par exemple, à des concentrations anormales d'hormones stéroïdes circulantes, et entrainer des dysfonctionnements de la reproduction et du développement. Durant les vingt dernières années, la communauté scientifique s’est beaucoup intéressée aux altérations du fonctionnement du système endocrinien des organismes suite à leur exposition à ces produits chimiques appelés perturbateurs endocriniens (PE).

Les PE regroupent des substances d’origines et de structures très variées. Leurs mécanismes d’actions sont multiples puisqu’ils peuvent potentiellement agir sur l’ensemble des étapes de la régulation endocrine depuis la synthèse des hormones jusqu’à la réponse des cellules cibles {Kavlock, 1996 #1032}{Kavlock, 1996 #1032}[1]. De nombreuses études ont montré des effets délétères de ces composés PE sur les capacités reproductives de la faune sauvage (invertébrés, poissons, oiseaux, reptiles), d’animaux d’élevage ainsi que de l’homme [2-5]. Chez différentes espèces de poissons, l’exposition à des PE a été associée à des effets néfastes sur la reproduction, à la fois au niveau des individus mais également au niveau de la population [6-9].

D’un point de vue réglementaire, ces composés PE ont été définis comme « des substances exogènes qui provoquent des effets néfastes sur la santé d’un organisme ou de sa descendance secondairement à des changements dans sa fonction endocrine » (WHO 2002). Plus récemment, le danger et le risque que représentent ces substances ont été pris en compte dans diverses réglementations européennes. C’est le cas notamment de la réglementation relative aux produits biocides et phytopharmaceutiques, qui a souhaité définir les critères scientifiques pour l'identification de ces substances [10, 11]. La méthodologie recommandée pour l’évaluation correspondante est indiquée dans le guide ECHA/EFSA pour l’identification des propriétés PE dans le cadre des réglementations de mise sur le marché des produits biocides (N° 528/2012/EC) et « phytopharmaceutiques » (N° 1107/2009) [12]. Dans ce cadre, il est prévu de démontrer à la fois un mode d’action de type PE, des effets néfastes à des niveaux d’organisation biologique pertinents pour l’évaluation des dangers et le lien de cause à effet entre les deux.

Pour arriver à ces fins, la traduction des déficits fonctionnels chez les individus en effets au niveau des populations constitue donc un enjeu [13]. Cette extrapolation des données de toxicité individuelles, à partir des mesures faites en laboratoire, à l’échelle des populations pour évaluer les conséquences sur la viabilité des populations (unité biologique que l'on vise à protéger) n'est pas triviale [14].

Dans ce contexte, la proposition de voies de toxicité, dite AOP (« adverse outcome pathway »), reliant les effets aux différentes échelles d’organisation biologique et la modélisation multi-échelles apportant une dimension quantitative à ces voies de toxicité (AOP quantitative, qAOP) permettent, d’une part, cette extrapolation des effets néfastes entre niveaux d’organisation biologique et, d’autre part, de mettre en évidence le lien de cause à effet entre un mode d’action et des effets sur les populations [15-17]. Les modèles mathématiques sont des outils adaptés pour intégrer différentes échelles biologiques, différents types d’observations et leurs relations [14]. Ainsi, la modélisation multi-échelles des voies de toxicité vise à développer des outils de modélisation mécaniste ou statistique permettant notamment à terme une utilisation dans un contexte réglementaire. Dans ce but, des modèles mathématiques mécanistes couvrant les différents niveaux biologiques ont été développés chez le poisson zèbre à l’Ineris : un modèle pharmacocinétique à fondement physiologique (PBPK) décrivant le devenir de perturbateurs endocriniens dans l’organisme [18, 19], un modèle de dynamique des hormones stéroïdiennes prédisant la synthèse de vitellogénine (projet PNRPE « MOZAIC ») et un modèle multi-agents pour simuler la dynamique des populations et sa perturbation due à l'exposition aux PE [20].

Un des mécanismes d’action de perturbation endocrinienne souvent étudié, en raison de son lien direct avec la reproduction, est la perturbation du cytochrome P450 aromatase au niveau des gonades (Aromatase A, codée par le gène cyp19a1a). C’est d’ailleurs une des rares voies de toxicité pour laquelle une AOP est disponible ([21]). De plus, une version quantitative de cette AOP (figure 1) a été développée chez le vairon à tête-de-boule (Pimephales promelas) et mise en application sur un fongicide PE, le fadrozole, en intégrant des relations quantitatives existantes entre chaque évènement clé [15, 22-24]. Ces relations semblent pouvoir être transposées chez d’autres espèces proches, le poisson zèbre et le medaka [25]. Cependant, certains aspects de cette première qAOP nécessiteraient d’être améliorés pour accroître leur opérationnalité en évaluation des risques. En effet, à ce jour, les modèles n’intègrent ni les contraintes écologiques, ni les phénomènes de rétrocontrôle, et les prédictions des impacts sur les populations peuvent être améliorées (par exemple, un rétrocontrôle de la dynamique de population par les phénomènes de densité-dépendance).

Ces données toxicologiques sur les perturbations de la reproduction (concentrations en E2 et en VTG circulantes, fécondité des femelles) acquises pour différents PE peuvent être directement utiles pour améliorer l’existant et développer une AOP quantitative chez le poisson zèbre (Danio rerio) permettant de prédire de façon quantitative les effets néfastes des PE sur la viabilité des populations. De plus, ces travaux nous offrent l’opportunité de qualifier l’apport d’une qAOP lors de la mise en œuvre de la méthodologie proposée par le guide ECHA/EFSA pour l’identification des propriétés PE [12].En se basant sur cette AOP, des données originales ont déjà été produites chez le poisson zèbre à l’Ineris pour différents PE d’intérêt environnemental : le prochloraz, l’imazalil, le clotrimazole, le gestodène et la noréthindrone (projet ANSES AIDEZ APR EST 2016). En effet, pour ces cinq substances, des données de fécondité, de concentrations en estradiol (E2) et vitellogénine (VTG) circulantes et d’expression du gène cyp19a1a ont été obtenues à l’aide d’une lignée de poissons zèbres transgéniques cyp19a1a-eGFP. Cette lignée transgénique permet de suivre les effets temps- et concentration-dépendants des substances étudiées sur l’expression du gène de l’aromatase A (cyp19a1a), sans augmenter le nombre d’animaux nécessaires aux essais. De plus, certaines molécules testées entrainent des perturbations de la reproduction, en particulier une baisse de la fécondité, qui ne semblent pas être médiées par une perturbation de l’aromatase, mais résulter d’une autre voie de toxicité : voie de signalisation des progestatifs.

Le projet GinFiz vise à développer et tester de nouvelles méthodes pour caractériser les effets non-intentionnels des produits phytopharmaceutiques sur les populations de poissons, en particulier les impacts résultant d’atteintes du système endocrinien des individus. L’objectif global du présent projet sera donc le développement et l’amélioration d’une qAOP conduisant à une baisse de la fécondité afin de prédire précisément les impacts des PE pour les différents niveaux biologiques (des doses internes accumulées jusqu’aux effets sur les populations). Pour cela, trois objectifs seront visés :

• Enrichir la version quantitative de l’AOP basée sur l’aromatase A, en particulier, pour prédire précisément les impacts sur les populations, en utilisant les modèles mathématiques mécanistes disponibles à l’Ineris pour le poisson zèbre [18, 20], les données toxicologiques produites dans le projet AIDEZ, et en produisant de nouvelles données sur la dynamique des hormones stéroïdiennes.
• Intégrer à cette qAOP une autre voie de toxicité pour les PE impactant probablement la voie de signalisation des progestatifs et conduisant à une diminution de la fécondité du poisson zèbre.
• Utiliser cette qAOP, ainsi que l’ensemble des données produites, dans un contexte réglementaire afin d’en démontrer l’intérêt dans la mise en œuvre du guide ECHA/EFSA pour l’identification des propriétés PE.

L’originalité du projet GinFiz réside en partie dans la production de nouvelles données notamment grâce à la lignée transgénique cyp19a1a-eGFP et aux dosages précis des hormones stéroïdiennes circulantes chez le poisson zèbre. Ces données permettront de développer une qAOP de l’aromatase gonadique chez le poisson zèbre et donc de diversifier les espèces aquatiques utilisées pour l’évaluation des PE.

De plus, l’ensemble des modèles mécanistes mathématiques développés permettront d’enrichir la qAOP existante [15] en prédisant les impacts sur les différents niveaux biologiques (des doses internes accumulées jusqu’aux effets sur les populations) en intégrant les contraintes écologiques (nourriture et température) et les phénomènes de régulation pour se rapprocher des conditions environnementales d’exposition.

Enfin, dans un contexte réglementaire où l’identification des PE est notamment conditionnée par une démonstration des modes d’action postulés, mais où la méthodologie correspondante (guide ECHA/EFSA) n’a encore été que peu éprouvée à ce stade, l’intégration d’une qAOP sera une approche originale permettant d’améliorer l’évaluation des dangers de ces substances.

Le présent projet sera organisé autour de quatre tâches tel que décrit dans la figure 3 : la première tâche sera dédiée à la coordination et la tâche 4 à la valorisation et la dissémination. Les autres tâches constitueront le cœur du projet. La tâche 2 est dédiée à l’acquisition de données, au développement de modèles et à la construction de la qAOP, et la tâche 3 abordera l’utilisation de la qAOP dans un contexte réglementaire.

Figure 3 : Schéma de structuration du projet GINFIZ.

UMR-I 02 SEBIO est en charge de la coordination et fortement impliqué dans tâche 2 : "construction de la qAOP".